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对高速离心计心情疾速提取细胞RNA的尝试步骤

宣布时候:2014-01-08        [字体:    ]        阅读次数:135
       高速冷冻离心计心情转速可达10000rpm以上,具备冷冻离心计心情的机能和布局外,高速冷冻离心计心情所用角式回头多接纳用钛合金或铝合金制成。离心管为具盖聚乙烯硬塑料成品。这类离心计心情多用于搜集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸积淀物和免疫积淀物等。高速离心计心情疾速提取细胞RNA有哪些步骤?上面小编给大师阐发: 
  1. 构造培育细胞
  a. 搜集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管,对贴壁细胞,孔板培育能够间接裂解,细胞瓶培育应当先用胰卵白酶消化后奏乐上去搜集。
  b. 13,000rpm离心10秒(或300g离心5分钟),使细胞积淀上去。完整吸弃上清,留下细胞团,注重不完整弃上清会浓缩裂解液致使产量纯度下降。
  c. 轻弹管壁将细胞积淀完整疏松重悬,插手350μl(<5x106细胞)或600μl(5x106-1x107细胞)裂解液RLT,奏乐混匀后用手猛烈振荡20秒,充实裂解。
  d. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 打针器抽打裂解物 5-10 次或直到获得对劲匀浆成果(或电动匀浆30秒),能够剪切DNA,下降黏稠度和进步产量。
  e. 接操纵步骤项下。
  2. 较切确估量裂解物(上清)体积,插手等体积的70%乙醇(请先查抄是不是已插手无水乙醇!),此时能够呈现积淀,可是不影响提取进程,当即奏乐混匀,不要离心。
  3. 立即将夹杂物(每次小于700μl,多能够分两次插手)插手一个吸附柱RA中,(吸附柱放入搜集管中)13,000 rpm离心60秒,弃掉废液。
  4. 加700μl 去卵白液RW1,室温安排30秒,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。若是DNA残留较着,可在插手RW1后室温安排5分钟再离心。
  5. 插手500μl漂洗液RW(请先查抄是不是已插手无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。插手500μl漂洗液RW,反复一遍。
  6. 将吸附柱RA放回空搜集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽可能撤除漂洗液, 以避免漂洗液中残留乙醇按捺下流反映。
  7. 掏出吸附柱RA,放入一个RNase free离心计心情离心管中,按照预期RNA产量在吸附膜的中心部位加30-50μl RNase free water(事前在 70-90℃水浴中加热可进步产量), 室温安排1分钟,12,000 rpm 离心1分钟。
  8. 若是预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water反复步骤8, 归并两次洗脱液,或利用第一次的洗脱液加回到吸附柱反复步骤一遍(若是须要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱归并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,可是浓度要低,用户按照须要挑选。
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